? ? ? ?單分子定位顯微鏡（single-molecule localization microscopy, SMLM）具有納米級的超分辨能力，已成為結構細胞生物學研究的重要手段。其中多通道的SMLM的各種擴展應用至關重要，因為它們極大地增加了可以從樣本中提取的信息量：用不同顏色的熒光團標記的蛋白質多色SMLM成像可以探測它們的空間關系和相互作用。通常使用兩個光譜通道[1-3]或一個空間通道與另一個光譜檢測通道相結合來實現[4]。使用兩個或多個探測通道的三維(3D)SMLM技術，例如雙平面[5]或多平面探測[6]、自彎曲點擴散函數[7]、超臨界角度熒光探測[8,9]、多相位干涉[10,11]、多通道熒光偏振[12]等，在研究生物結構的內在三維空間組成方面發揮重要作用。
? ? ? ?2022年6月7日，南方科技大學李依明副教授、歐洲分子生物學實驗室Jonas Ries研究員課題組合作在Nature Communications上發表了題為“Global fitting for high-accuracy multi-channel single-molecule localization”的研究。提出一種基于GPU加速的多通道全局擬合算法globLoc，用于三維單分子定位，它可以從多通道單分子數據中提取最大信息，提高了雙平面和4Pi-SMLM的定位精度，并改善了比率多色三維SMLM的顏色分類。
? ? ? ?與單通道SMLM相比，多通道的數據分析相對比較復雜，因為必須把兩個或多個通道結合起來才能得到額外的信息(顏色、z位置、偏振狀態、干涉相位等)。傳統的方法是首先在每個通道中分別擬合熒光團以提取相應的參數，然后組合從不同通道返回的參數來獲得額外信息。單個熒光團在多個通道中的單獨擬合不是最佳的，因為忽略了高度相關的信息(例如三維位置和光子等)。相反，如果我們使用一個全局擬合器來鏈接不同通道中的相關參數，這將減少擬合參數的數量，提高擬合的精度和魯棒性，并避免不同通道中相應參數配對時引發的不確定性。因此，研究人員開發了多通道全局擬合方法globLoc，并設計了一個通用的數據分析工作流程，方便使用軟件對不同通道中檢測到的單分子數據進行全局擬合。其優化的分析流程包括: 生成通道之間的轉換映射關系，校準全局多通道PSF，基于GPU的全局擬合器實現快速和精確定位，以及后處理程序提取額外的信息(z位置，顏色，干涉相位，偏振等)。在仿真和實驗數據中，研究人員發現全局擬合能夠顯著提高雙平面和4Pi-SMLM的定位精度以及多色SMLM的顏色分類。
? ? ? ?以雙通道為例對全局擬合分析流程(圖1)進行說明。首先對蓋玻片表面的熒光珠在Z方向進行掃描，并單獨計算每個通道的樣條PSF模型[13]，再分別用相應的樣條PSF模型對每個通道進行擬合，以獲得精確的熒光珠位置。從兩個通道中對應的珠子位置，計算出通道之間的映射關系。然后使用三次多項式插值來對大量的熒光珠進行配準和平均，同時保持映射過程中通道之間固定的空間關系。此外，也可以使用相應的PSF模型分別對每個通道中的單分子數據進行分析，并根據擬合的坐標計算映射關系。除了使用實驗型的PSF模型，還支持用高斯PSF模型進行全局擬合。在校準多通道PSF模型和不同通道之間的映射關系之后，最后進行全局擬合，使用極大似然估計(maximum likelihood estimation，MLE)聯合分析多通道數據。
圖1 多通道全局擬合方法的工作流程概述。
（圖源：Yiming?Li,?et al.,?Nat Commun, 2022）
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? ? ? ?由于globLoc可以靈活地鏈接不同通道之間的參數，研究人員比較了在單獨擬合，全局擬合下對鏈接XYZ位置和鏈接XYZ以及發射光子情況下的定位精度。與擬合單獨通道然后對位置進行Cramer-Rao-Lower-Bound（CRLB）加權平均相比，globLoc提高了大約1.5倍的z定位精度(圖2a)和更加魯棒的參數估計。這一分辨率的提高通過參加持續舉辦的2016 SMLM Software Challenge得到了進一步證實，在該挑戰賽中，globLoc在雙平面數據上的3D定位精度比其他表現最好的算法LEAP提高了近兩倍(圖2b)。對訓練數據集(模擬微管)，與主要的SMLM分析軟件ThunderSTORM (圖2c)相比，有了明顯的改善。對核孔復合體(nuclear pore complex，NPC)上標記的Nup96蛋白質實驗數據結果顯示，globLoc相比ThunderSTORM改善更為明顯，globLoc能夠清晰地解析NPC的雙層環狀結構(圖2d)。
圖2 globloc用于分析雙平面數據
（圖源：Yiming?Li,?et al.,?Nat Commun, 2022）
? ? ? ?globLoc不限于雙通道的數據分析，研究人員利用實驗4Pi-PSF模型[14]，對具有多相位干涉的4Pi-SMLM進行四通道擬合。通過使用樣條插值實驗PSF模型對所有四個相位圖像進行全局擬合，globLoc在所有維度上都實現了定位精度逼近CRLB。并且與當前主要的分析方法相比，精度和準確性都大大提高(圖3a)。在4Pi-SMLM實驗數據上，對比在核孔復合體中Nup96八聚體的團簇重建結果，globLoc在所有參數鏈接的情況下重建出來的團簇相比于當前主要的分析方法(photometry)和不鏈接光子的globLoc重建的團簇更小(圖3b)，更接近真實樣品結構。
圖3 globloc用于分析4pi-smlm數據
（圖源：Yiming?Li,?et al.,?Nat Commun, 2022）
? ? ? ?globLoc的全局擬合對具有重疊發射光譜的多種染料進行成像分析，根據在每個通道中檢測到相對光子數量區分單個分子的顏色(圖4a)。globLoc提高了定位光子數的準確性，從而在模擬和實驗中提高了顏色分類的準確性(圖4b)?，同時利用綜合利用了所有檢測到的光子進行定位，沒有造成光子數的損失。globLoc的這些創新使得在比率分色3D SMLM(圖4C)中首次對四種染料同時成像并準確地區分出四種顏色。實驗驗證中采用AF647、DY634、CF660C和CF680染料對單個NPC的Nup96、Nup62、Elys和WGA蛋白標記后的成像結果顯示，四種顏色沒有明顯的串擾。研究人員對200個NPC圖像進行了平均，得到了四種NPC蛋白質的平均后的結構位置，其中 Nup96 形成兩個具有八聚體對稱性的環，Elys形成一個大環，Nup62和WGA位于圓環的中央通道。值得注意的是，這些是熒光團的平均分布，由于抗體大小及其非隨機方向可能會引起的連接錯誤而導致的表位的分布不同。
圖4 globloc用于分析多色數據
（圖源：Yiming?Li,?et al.,?Nat Commun, 2022）
? ? ? ?為了證明globLoc在具有挑戰性的樣本上的表現，研究人員對線蟲的聯會復合體進行了比率三色3D成像(圖5a)。單個的聯會復合體可以在三維空間內清楚地分辨出來(圖5b)。聯會復合體的三種不同成分HTP-3、HIM-3和SYP-5的N端被很好地分離出來，沒有明顯的顏色串擾，并且這三種組分的空間排列與之前的研究非常吻合。
圖5 globloc用于線蟲聯會復合體多色三維成像。
（圖源：Yiming?Li,?et al.,?Nat Commun, 2022）
? ? ? ?綜上所述，研究人員證明了在多通道單分子定位過程中鏈接共享參數大大提高了定位精度，并減少了顏色分配串擾。globLoc不僅提高了定位精度，而且與單獨擬合多個通道相比，還增加了擬合的魯棒性。這一點很重要，因為信息被分成不同的通道，并且每個通道的信噪比（SNR）較差，這導致參數估計的誤差很大。結果表明，globLoc可以在較大的軸向范圍內精確地重建雙平面和4Pi-SMLM數據，并在四種顏色同時成像時能進行準確地區分。基于深度學習的SMLM分析已被證明可以大大提高定位精度，特別是對于單分子密度較高的數據，然而，深度學習方法依賴于訓練有素的網絡，這些網絡需要針對不同的成像條件(如不同的信噪比)進行再訓練。對于多通道數據分析，由于不同的成像模式(如雙平面、比率多色)需要采用不同的參數鏈接方案，因此情況要復雜得多。因此，基于深度學習的方法非常適合于單通道高密度單分子數據，而全局分析法將成為多通道標準密度數據分析的首選方法。
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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-30719-4
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14. Li, Y. et al. Accurate 4Pi single-molecule localization using an experimental PSF model. Opt. Lett. 45, 3765 (2020).
第一作者及共同通訊作者李依明（前排中間）
（照片提供自：李依明實驗室）
作者簡介：
李依明，2009年于上海交通大學獲生物醫學工程系學士，2010年獲海德堡大學醫學物理碩士，2015年獲卡爾斯魯厄理工學院博士學位（導師： Uli Nienhaus 教授）。之后獲得EMBL-瑪麗居里博士后獎學金，在歐洲分子生物學實驗室總部和耶魯大學任職博士后研究員和訪問學者（2016-2019）。現為南方科技大學生物醫學工程系副教授，博士生導師。長期致力于研究三維超高分辨顯微成像技術及其生物應用，在光學儀器研發，光學理論和成像算法等方面積累了堅實的理論基礎以及實驗經驗。迄今，以第一/通訊作者在Nature Methods、Nature?Communications、Optics Letters等國際權威期刊發表多篇論文，入選“深圳市海外高層次人才B類”，并長期擔任Nature Methods、 Light: Science & Applications、Optics Letters等期刊的審稿人。目前和包括來自EMBL，耶魯大學，牛津大學和劍橋大學等多個實驗室有合作關系。此外，課題組長期招收博士后、研究助理及博士/碩士研究生，有物理，光學工程、計算機、機械工程、生物醫學工程、生物技術、生物化學等相關專業背景，要求具備良好的學習能力、獨立工作能力和團隊溝通能力。有意者請將個人簡歷發送至李依明副教授郵箱：liym2019@sustech.edu.cn.
撰文︱李依明、石偉
責編︱王思珍
廣東省深圳市南山區
學苑大道1088號
bme@sustech.edu.cn
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